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2005年底,454公司推出了革命性的基于焦磷酸測序法的超高通量基因組測序系統--Genome Sequencer 20 System,被《Nature》雜志以里程碑事件報道,開創了邊合成邊測序的先河。2007年又推出了性能更優的第二代基因組測序系統--Genome Sequencer FLX System。2008年10月,454推出了全新的GS FLX Titanium系列試劑和軟件,讓GS FLX的通量一下子進步了5倍,正確性和讀長也進一步提升。

454型測序儀

GS FLX 測序原理

GS FLX系統的測序原理和GS 20一樣,也是一種依靠生物發光進行DNA序列分析的新技術;在DNA聚合酶,ATP硫酸化酶,熒光素酶和雙磷酸酶的協同作用下,將引物上每一個dNTP的聚合與一次熒光信號開釋偶聯起來 (圖 1)。通過檢測熒光信號開釋的有無和強度,就可以達到實時測定DNA序列的目的。此技術不需要熒光標記的引物或核酸探針,也不需要進行電泳;具有分析結果快速、正確、靈敏度高和自動化的特點。

Roche GS FLX System是一種基于焦磷酸測序原理而建立起來的高通量基因組測序系統。在測序時,使用了一種叫做“Pico TiterPlate”(PTP)的平板,它含有160多萬個由光纖組成的孔,孔中載有化學發光反應所需的各種酶和底物。測序開始時,放置在四個單獨的試劑瓶里的四種堿基,依照T、A、C、G的順序依次循環進進PTP板,每次只進進一個堿基。假如發生堿基配對,就會開釋一個焦磷酸。這個焦磷酸在各種酶的作用下,經過一個合成反應和一個化學發光反應,終極將熒光素氧化成氧化熒光素,同時開釋出光信號。此反應開釋出的光信號實時被儀器配置的高靈敏度CCD捕捉到。有一個堿基和測序模板進行配對,就會捕捉到一分子的光信號;由此逐一對應,就可以正確、快速地確定待測模板的堿基序列。

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